MnJ(β) 胶体锰佐剂产品介绍 MnJβ胶体锰佐剂是一种锰元素含量为5 mg/mL的锰纳米颗粒水性佐剂。其核心原理是利用Mn2+ 激活cGAS-STING 信号通路1-3，在注射部位迅速地诱导固有免疫反应、直接促进树突状细胞成熟并提呈抗原，进而高效启动适应性免疫应答并产生免疫记忆4,5。MnJβ胶体锰佐剂可用于小鼠、家兔等多种动物的单/多克隆抗体制备6,7，也可用于各种预防和治疗性疫苗的创制研究8,9。
产品优势 与弗氏佐剂、铝佐剂、白油佐剂等传统经典佐剂相比，MnJβ胶体锰佐剂的优势包括： 1）使用方便； 2）抗体产生快，抗体亲和力强； 3）可以有效激活细胞免疫； 4）作用机制明确，无毒副作用； 5）所配制疫苗可冻存或反复冻融； 6）对于免疫原性弱或其它佐剂无法发挥作用的抗原/半抗原依然能免疫获得有效抗体。
质量控制 MnJβ胶体锰佐剂有效锰含量5 mg/mL，密度和水接近，自然沉降条件下颗粒物固体体积不低于90%，内毒素低于1 EU/mL。当使用磷酸盐缓冲液PBS将MnJβ胶体锰佐剂稀释到工作浓度1 mg/mL并充分振荡后，在自然沉降条件下静置24小时此稀释液中固体颗粒物体积不小于50%。 保存条件 10 -25 ℃ 室温保存，有效期1年。
注意事项和免责声明 本产品长期静置后可能会出现分层并有少量上清产生，使用前要充分混匀，使其充分重悬后方可使用。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
参考文献 1 Wang, C. et al. Manganese Increases the Sensitivity of the cGAS-STINGPathway for Double-Stranded DNA and Is Required for the Host Defense againstDNA Viruses. Immunity 48,675-687 e677, doi:10.1016/j.immuni.2018.03.017 (2018). 2 Hooy, R. M., Massaccesi, G., Rousseau,K. E., Chattergoon, M. A. & Sohn, J. Allosteric coupling between Mn2+ anddsDNA controls the catalytic efficiency and fidelity of cGAS. Nucleic Acids Res48, 4435-4447,doi:10.1093/nar/gkaa084 (2020). 3 Zhao, Z. et al. Mn(2+) Directly Activates cGAS and Structural AnalysisSuggests Mn(2+) Induces a Noncanonical Catalytic Synthesis of 2'3'-cGAMP. Cell reports 32, 108053,doi:10.1016/j.celrep.2020.108053 (2020). 4 Li, X. D. et al. Pivotal roles of cGAS-cGAMP signaling in antiviral defenseand immune adjuvant effects. Science341, 1390-1394, doi:10.1126/science.1244040 (2013). 5 Zhang, R. et al. Manganese salts function as potent adjuvants. Cell Mol Immunol 18, 1222-1234,doi:10.1038/s41423-021-00669-w (2021). 6 Fang, R., Jiang, Q., Jia, X. &Jiang, Z. ARMH3-mediated recruitment of PI4KB directs Golgi-to-endosometrafficking and activation of the antiviral effector STING. Immunity 56, 500-515 e506,doi:10.1016/j.immuni.2023.02.004 (2023). 7 Liu, X., Yao, J., Zhao, Y., Wang, J.& Qi, H. Heterogeneous plasma cells and long-lived subsets in response toimmunization, autoantigen and microbiota. Nat Immunol23, 1564-1576, doi:10.1038/s41590-022-01345-5(2022). 8 He, X. et al. A human cell-based SARS-CoV-2 vaccine elicits potentneutralizing antibody responses and protects mice from SARS-CoV-2 challenge. Emerg Microbes Infect 10, 1555-1573,doi:10.1080/22221751.2021.1957400 (2021). 9 Wang, Z. et al.Colloidal Manganese Salt Improves the Efficacy of Rabies Vaccines in Mice,Cats, and Dogs. J Virol95,e0141421, doi:10.1128/JVI.01414-21 (2021). 用于单/多克隆抗体制备 （1）抗原/佐剂混合 根据不同动物选择合适的免疫剂量。对于家兔，参考免疫抗原量为200-1000 μg；对于大鼠，参考免疫抗原量为100-500 μg；对于小鼠，参考免疫抗原量在10-100 μg。MnJβ锰佐剂推荐工作浓度为0.5-1 mg/mL，推荐使用量为免疫抗原量的5-10倍。以小鼠为例，将60 μg抗原与300 μg (60 μL) MnJβ锰佐剂用vortex涡旋仪混合均匀并室温静置3-5分钟，再加入磷酸盐缓冲液PBS或者生理盐水至佐剂的浓度为1 mg/mL，再次用vortex涡旋仪充分混合均匀后，即可用于小鼠免疫。抗原与佐剂的混合需现配现用，在30分钟内完成免疫接种效果最佳。
（2）免疫接种方法 MnJβ锰佐剂适用于肌肉、皮下、腹腔、粘膜等多种位点的免疫。大型动物多为皮下或肌肉免疫，小型动物可采用腹腔等其它的免疫部位。以小鼠为例，前述300 μL的抗原佐剂混合物可全部用于腹腔免疫，或者肌肉、皮下、腹腔多点免疫（左右大腿各50 μL，皮下左右两点各50 μL，腹腔100 μL）。多数情况下，分散的多点免疫效果更好。
（3）免疫周期 首次免疫和第二针免疫间隔7-14天，后面每针间隔7天。多数情况下，首次免疫和二次免疫之间间隔较长的14天要比间隔较短的7天更有利于获取高亲和力抗体。免疫流程结束一周以后，实验动物的血清无需纯化即作为多抗用于WB/ELISA等实验；两周以后，其脾脏细胞可用于杂交瘤制备和单抗筛选。为了获取更多更高亲和力抗体，推荐免疫实验动物三到四次。由于通过腹腔注射的MnJβ锰佐剂会一过性地富集于脾脏，而前者会显著影响杂交瘤制备及其后续筛选过程。因此，如果需要在分离脾脏细胞之前，通过再次注射抗原的方法进行免疫激发，注意在这次额外的免疫激发不要通过腹腔注射而是进行肌肉/皮下注射，或者考虑只使用抗原进行注射而不添加锰佐剂。
（4）其他动物的免疫接种方法 如果要在其他动物上MnJβ锰佐剂应用于抗体制备，可以参考下列流程设计免疫接种方案。首先，需要确定所使用抗原类型在所要免疫动物上的常规最佳用量。例如，在某种动物中使用弗氏佐剂以制备多克隆抗体为目的时，所用于免疫注射的重组蛋白类抗原多数情况下是1mg，那么这个1mg同样也是适合于锰佐剂的抗原用量，此信息需要使用者根据具体情况自行确定。之后，按照1:5-10的比例根据抗原用量确定锰佐剂的用量；在上一个例子中，可以根据1mg的抗原用量确定锰佐剂的用量在5-10mg左右。进一步，根据MnJβ锰佐剂推荐工作浓度1 mg/mL和锰佐剂的用量确定免疫注射体积；因此，在上述例子中注射体积为5-10mL。最后，根据不同注射部位的锰佐剂吸收能力，最终确定注射方案：如果具体操作可行的话，腹腔注射是吸收能力最强、免疫效果最好的单一注射途径。如果具体动物的腹腔操作有困难的话，则推荐进行多点的肌肉/皮下注射；对于体型大于家兔的大动物，单个肌肉/皮下注射位点锰佐剂的极限吸收能力一般为0.5-1mg左右，超过此剂量的单位点的过多注射浪费抗原从而降低免疫效果。原则上，越多越分散的注射位点对于产生高亲和力的抗体越有利。 另外，MnJβ锰佐剂“推荐工作浓度为1 mg/mL”、“推荐使用量为免疫抗原量的5-10倍”。当某些情况下两者明显无法同时满足的时候，保持MnJβ佐剂在最终免疫注射液中的工作浓度为1 mg/mL是要最重要的，而不必强求抗原和锰佐剂的比例。例如，当抗原用量和注射体积都已经确定的情况下，最重要的是保持MnJβ佐剂的工作浓度为1 mg/mL，而并非锰佐剂和抗原用量的比例，需要特别注意。
用于疫苗创制研究 考虑到具体疫苗技术路线的多样性，这里仅能给出原则性参考使用方法：在疫苗注射液中按照10%-25%的体积分数添加MnJβ锰佐剂后，充分混合搅拌、振荡均匀后即可分装保存待用。由于MnJβ锰佐剂的密度和水性注射液的密度接近，因此10%-25%的体积分数同样也是质量分数。含有锰佐剂的疫苗注射液的理想物化状态应是米汤样悬浊液，透过光源观察可以看到非常连续的絮状固体，在自然沉降条件下，72小时以内沉降的絮状固体体积不应小于澄清上清的液体体积，而且稍加颠倒混匀以后即可恢复米汤样悬浊液的形状。 一般情况下，MnJβ锰佐剂和水溶性免疫激动剂没有明显的配伍禁忌可以尝试搭配使用，但是，锰佐剂基本无法和水包油、油包水等油性乳液型佐剂稳定共存。一方面，锰佐剂的纳米颗粒很可能会破坏微乳滴的稳定结构；另一方面，油性物质会破坏MnJβ锰佐剂的Mn2+释放效果，从而使得两者均无法发挥其设计功能。 MnJβ锰佐剂偏好中性的疫苗注射液环境，酸碱度低于5-6以下的过酸环境会显著破坏锰佐剂持续释放Mn2+的能力；而酸碱度高于9-10以上的过碱条件中则会生成不稳定的氢氧化锰类物质。 如果不确定使用锰佐剂配制出的疫苗是否符合要求，除了进行常规抗体生成测试以外，这里提供一个快速检测方案。将含有100μg锰佐剂的疫苗注射液全部注射进入小鼠腹腔，18小时后，使用5mL磷酸盐缓冲液PBS灌洗小鼠腹腔并抽取出不少于3mL的腹腔灌洗液。正常情况下，应当在此腹腔灌洗液中检测到不少于106个的CD11b+ Gr-1+中性粒细胞、CD11b+ F4/80+单核巨噬细胞和CD3- NK1.1+自然杀伤NK细胞。此现象是锰佐剂成功释放Mn2+并激活小鼠固有免疫应答的早期现象。如果此现象消失或者非常显著的减弱，则要考虑锰佐剂的设计功能被疫苗中的某些组分破坏，从而无法有效地在疫苗中发挥出佐剂效果。 更多涉及到疫苗应用中锰佐剂的具体问题，欢迎直接向本公司反馈，我们将第一时间提供帮助和建议。
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